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TUNEL凋亡顯色法

TUNEL (TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling)法檢測細胞凋亡的原理是當細胞發(fā)生凋亡時，DNA內(nèi)切酶被激活，核小體間的基因組DNA被切斷，暴露的3'-OH可以在末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶(Terminal Deoxynucleotidyl Transferase, TdT)

加上帶有生物素(Biotin) 標記的dUTP即Bitin-dUTP.,隨后于辣根過氧化物酶 (HRP) 標記的streptavidin結(jié)合， 在HRP的催化下通過DAB顯色來顯示凋亡細胞,從而可以通過普通光學(xué)顯微鏡檢測到細胞凋亡。

實驗意義

1. TUNEL法是一種分子生物學(xué) 與形態(tài)學(xué)相結(jié)合的研究方法，可對完整的單個凋亡細胞或者凋亡小體進行原位染色，可以準確反映細胞凋亡典型的生物化學(xué)和形態(tài)特征。

2.可用于石蠟切片冰凍切片培養(yǎng)的細胞等進行細胞凋亡檢測，靈敏度遠比一般的組織化學(xué)和生物化學(xué)方法要高。

3.操作簡便快捷，在細胞凋亡的研究中被廣泛采用。

實驗步驟

1.石蠟切片TUNEL顯色法:

①石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，脫蠟劑二甲苯，至水劑乙醇;

②PBS漂洗3*5 min; .

③加入蛋白酶K工作液37°C反應(yīng)15-30 min, PBS漂洗3x5 min;

④4%多聚甲醛(pH7 .4的PBS)室溫固定15-30 min, PBS漂洗3x5 min;

⑤浸入封閉液(3%H202)室溫封閉10 min, PBS漂洗3x5 min;

⑥加入適量TdT酶反應(yīng)液，暗濕盒中37°C反應(yīng)1 h,用SSC室溫15 min終止反應(yīng)后,PBS漂洗3x5 min; .

⑦浸入0.3% H202封閉內(nèi)源性過氧化物酶活性，室溫孵育3-5 min, PBS漂洗3x5 min;

⑧滴加Streptavidin-HRP工作液，37*C反應(yīng)30-60 min, PBS漂洗3x5 min;

⑨滴加DAB顯色液后用去離子水漂洗數(shù)次;

10.選擇是否用DAPI復(fù)染細胞核;

脫水、透明、中性樹膠封片后進行觀察。

2.冰凍切片TUNEL顯色法:

①新鮮組織經(jīng)處理后，立即在恒冷冰凍切片機內(nèi)切片，厚度為5~6 um;

②防脫玻片，貼片，室溫陰干約12 h;

③4%多聚甲醛(pH7 4的PBS)室溫固定10 min, PBS漂洗3x5 min;

④浸入封閉液(3%H202)室溫封閉10 min, PBS漂洗3x5 min;

⑤浸入邇透液(0.1% Triton X-100溶于PBS中)，室溫通透30 S-2 min;

⑥加入適量TdT酶反應(yīng)液，暗濕盒中37°C反應(yīng)1 h,用SSC室溫15 min終止反應(yīng)后，PBS漂洗3x5 min; .

⑦浸入0.3% H2O2封閉內(nèi)源性過氧化物酶活性，室溫孵育3-5 min, PBS漂洗3x5 min;

⑧滴加Streptavidin-HRP工作液，379C反應(yīng)30-60 min, PBS漂洗3x5 min;

⑨滴加DAB顯色液后用去離子水漂洗數(shù)次:

@選擇是否用DAPI復(fù)染細胞核;

脫水、透明、中性樹膠封片后進行觀察。

實驗完成周期及交付標準

1.實驗周期: 1-2周

2.交付標準:蠟塊、切片、染色圖片.實驗報告(實驗步驟、試劑、耗材等)

需確認的信息

1.樣本的種屬.

2.樣本的類型(固定的組織or蠟塊or切片)

3.是否提供試劑盒

4.拍照要求

實驗代做服務(wù)：